方法步驟：
1） 前一天轉(zhuǎn)形的培養(yǎng)皿，當(dāng)菌落長(zhǎng)至約0.5 mm 大小時(shí)，將培養(yǎng)皿移至4℃放置1 h。
2） 準(zhǔn)備一張無(wú)菌的硝化纖維濾膜，以鉛筆在邊緣標(biāo)上組別。
◆ 請(qǐng)戴手套后再拿取濾膜！
3） 打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋子，以兩支扁平鑷子將濾膜兩邊夾住，輕輕覆蓋在菌落上方，盡可能避免有氣泡產(chǎn)生。
◆ 注意！濾膜覆蓋上去后就不要再移動(dòng)！
4） 等濾膜*濕透后，以針頭在濾膜邊緣戳洞做記號(hào) （至少做三個(gè)記號(hào)）。小心把濾膜掀起，菌落朝上放置在LB/Amp/IPTG plate 上。蓋上蓋子，在37℃培養(yǎng)2~4 h，以誘導(dǎo)啟動(dòng)T5 promoter，表現(xiàn)其下游基因。原培養(yǎng)皿則置回37℃使菌落再長(zhǎng)出。
5） 將培養(yǎng)皿蓋子打開(kāi)，培養(yǎng)皿移至充滿chloroform 蒸氣的干燥器中，置放30min。
6） 取一個(gè)空petri dish 或適當(dāng)大小容器，加入20 mL lysis buffer。 把已經(jīng)過(guò)chloroform 溶菌的濾膜浸入lysis buffer，在室溫震蕩30 min。
7） 將濾膜以PBS 浸洗搖蕩10 min，再更換PBS 繼續(xù)浸洗10 min。
8） 將濾膜浸于明膠NET 溶液中，室溫?fù)u蕩1 h。
9） 濾膜以PBST 浸洗兩次，每次10 min。
10） 一次抗體以明膠NET 溶液適當(dāng)稀釋?zhuān)賹V膜浸入，于室溫?fù)u蕩1 h。
11） 濾膜以PBST 浸洗兩次，繼以PBS 浸洗一次，每次10 min。
12） 將濾膜置于二次抗體溶液中 （以明膠NET 稀釋?zhuān)?，于室溫?fù)u蕩1 h。
13） 濾膜以PBST 浸洗兩次，繼以PBS 浸洗一次，每次10 min。
14） 以DAB 溶液進(jìn)行呈色反應(yīng)。觀察呈色情形，當(dāng)訊號(hào)可明顯與背景區(qū)別時(shí)，將濾膜以水浸洗數(shù)次，以中止呈色反應(yīng)。
15） 將濾膜置于濾紙或吸水紙上干燥后與原培養(yǎng)皿對(duì)照，標(biāo)出有正反應(yīng)的菌落位置。濾膜以膠膜護(hù)貝，避光貯存。
16） 選取數(shù)個(gè)正反應(yīng)菌落，以劃單一菌落的方式分別接種在LB/Amp plate 上，置37℃培養(yǎng)直至菌落長(zhǎng)出。亦同時(shí)接種于3 mL LB/Amp 培養(yǎng)液，于37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，以抽取質(zhì)體，進(jìn)行限制酶分析。

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